Ce n'était vraisemblablement pas un fils de son prédécesseur, Amenhotep I. Il ne s'agit pas non plus d'un usurpateur : sa présence aux côtés d'Ahmès-Néfertary, veuve d'Ahmosis, en témoigne. Son épouse, la reine Ahmès, pourrait être apparentée à la famille royale, comme son nom pourrait l'indiquer.  
 
Son avènement, le 21e jour du troisième mois de peret, est documenté par les faire-parts qu'il a envoyé au vice-roi de Nubie, Touri (Urk. IV, 79-81).  
 
Ses opérations guerrières sont assez bien documentées par les autobiographies d'Ahmès fils d'Abana, d'Ahmès Pennekhbet et la grande stèle de Tombos (Urk. IV, 82-86). En l'an 2, il dirige une expédition vers le sud, franchit la 4e cataracte et atteint Kourgos, où il fixe la nouvelle frontière méridionale de l'Egypte. Cette attaque affaiblit considérablement les peuples de la région, et la civilisation de Kerma disparaît. D'après Ahmès, fils d'Abana, le roi rentre à Thèbes avec le cadavre du chef ennemi pendu à la proue du navire royal.  
 
Puis le roi se tourne vers l'Asie. Il atteint le Naharina, en Syrie actuelle. Au retour de sa campagne, il chasse l'éléphant dans la région de Niya. Ce geste que relate la propagande a sans doute une vocation symbolique : Thoutmosis I se pose en maître des éléments. Il affirme une conception impériale du pouvoir pharaonique. 
 
A cette extension des frontières s'ajoute un ambitieux programme architectural, qui trouve un écho à la fois dans des monuments encore en place aujourd'hui et dans l'autobiographie de l'architecte Inéni. A Karnak, il édifie une salle hypostyle, le Ve et vraisemblablement aussi le IVe pylône, ainsi qu'une enceinte. Des travaux sont également attestés à Karnak-nord, Memphis, Abydos, El-Hibeh, Erment et Eléphantine, ainsi qu'en plusieurs places de Nubie. 
 
La reine Hatshepsout, fille de Thoutmosis I et d'Ahmès, raconte qu'elle aurait été associée par son père aux affaires publiques dès l'an 2. Mais c'est d'une autre épouse, Moutnéfert, qu'est né Thoutmosis II, son successeur. 
 
La tombe de Thoutmosis I, construite par Inéni, n'est pas certainement identifiée. Il apparaît cependant probable qu'il s'agisse de KV 20, que la reine Hatshepsout aurait fait réaménager plus tard pour être enterrée avec son père. Puis, Thoutmosis III aurait déménagé les effets funéraires de Thoutmosis I, son grand père, dans la tombe KV 38, pour l'éloigner d'Hatshepsout. 
 
D'après Josèphe, abréviateur de Manéthon, Thoutmosis I aurait régné 12 ans et 9 mois, ce qui apparaît plausible (les sources l'attestent jusqu'en l'an 9 au moins). 
 
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